辛亥革命前后,曾在东京任《政闻社》总务员,在南京任都督府外交司司长并代理都督,在北京曾代理北京大学校长,任北京政府政治会议议员、参政院参政、平政院平政等职。在这期间,曾与章太炎、梁启超等发起创办“函夏考文苑”,与英华(字敛之。后为辅仁大学校长)创办辅仁社(即后来的辅仁大学)和培根女校。民国3年(1914年),马相伯子君远病故,学生们鉴于马公毁家兴字,家无余资,遂筹集万元为其寡媳、幼孙作教养费,马相伯却托人将该款移作启明女子中学(今第四中学)教育经费。袁世凯称帝后,他痛加抨击,认为“天下之大盗,莫大于君主”。民国6年(1917年)南归,隐居徐家汇土山湾(后名其居所为绿野堂、乐善堂),著书谈道,不问世事。
1925年,罗马教廷在中国创办北京公教大学,次年改称辅仁大学。马相伯参与其事,贡献良多。他寄语辅仁大学:“齐驱欧美,或更驾而上之。”