1932年10月15日晚，患病在上海休养的陈独秀最后一次被捕。在押送囚车上，他先是谈笑自若，可到了南京，却迟迟不下来。看守员大异，催问几次，发现陈独秀正呼呼大睡，后来陈说：“民不畏死，奈何以死惧之。”何应钦传讯他，他挥毫题赠“三军可夺帅，匹夫不可夺志也”。传讯毕，军政部的青年军人团团围住他，向他索书纪念，他欣然应允，直到墨汁写尽方才解围。法庭上，大律师章士钊说：“他已经不是共产党员，应该从轻处理。”陈独秀说：“章律师之辩护全系其个人意见，并未征求本人意见。” “我只承认反对国民党和国民政府，却不承认危害民国。政府并非国家，反对政府，并非危害国家。”
　　
　　　　在狱中，陈独秀的生活几乎与在家中一样，起初监狱不许他看书，他绝食抗议，狱方只能默许，他在牢房里摆了两个大书架，上面堆满了经史子集。比他小29岁的夫人潘兰珍每日来探视，两人行为亲密，旁若无人。陈独秀当时除了稿费没有任何收入，在狱中开销过大，多靠友人接济。胡适凡经过南京，总要去看他，有一次因故没去，陈独秀大发脾气，胡适听说后赶去说明和道歉，并按照陈提出的书目送去书籍。
　　
　　　　1937年，南京遭到日军轰炸，陈独秀被提前释放。蒋介石派朱家骅去游说，答应供给10万元经费和5个国民参政会委员的名额，要他组织一个新党。陈独秀嗤之以鼻：“蒋介石杀了我许多同志，还杀了我两个儿子，我和他不共戴天!现在大敌当前，国共第二次合作，既然国家需要他合作抗日，我不反对他就是了。”
　　
　　　　此时，陈独秀的学生、托派分子罗汉也来到南京，请八路军办事处叶剑英、李克农等帮助营救尚在狱中的托派分子，并重提与中共中央“合作抗日”的建议。周恩来、林伯渠、王若飞、叶剑英等都作出了热情友好的表示，在延安的毛泽东和张闻天代表中央对陈独秀等表示出欢迎的态度。
　　
　　　　恰在此时，中共驻共产国际代表王明和康生由莫斯科回到延安，当讨论到是否恢复与陈独秀合作抗日的问题时，王明声色俱厉地说：“斯大林正在雷厉风行地反托派，而我们却要联络托派，那还了得。如果斯大林知道了，后果是不堪设想的。所以，反对托派，不能仁慈手软，陈独秀即使不是日本间谍，也应说成是日本间谍。”
　　
　　　　会后，康生即在《解放》周刊发表《铲除日寇侦探民族公敌的托洛茨基匪徒》一文，诬指陈独秀等是每月领取300元津贴费的日本侦探。接着，《群众》和《新华日报》等也随声附和发表文章。许多知名人士对此困惑和不平，他们联名致信《大公报》说：“对彼蒙此莫须有之诬蔑，为正义，为友谊，均难缄默，特此代为表白……”
　　
　　　　陈独秀对汉奸的罪名大怒，立即致信《新华日报》，他说：“我坦白地告诉你们：我如果发现了托派有做汉奸的真实凭据，我头一个要出来反对，否则含沙射影、血口喷人地跟着你们做啦啦队，我一生不会干这样昧良心的勾当。”自此，陈独秀将他与中共中央之间的门彻底关闭，再不开启。